Proteiinipalvelut
Johdanto
Proteiinipalvelut tarjoaa proteiinien ekspressiota, puhdistusta ja karakterisointia. Proteiinit tuotetaan bakteeri-, hyönteis- ja nisäkkäsoluissa, mikä tarjoaa laajan valikoiman ekspressio- ja muokkausmahdollisuuksia erilaisiin biologisiin kokeisiin. Proteiineja voidaan käyttää rakenteellisessa biologiassa, proteiini-ligandi- ja proteiini-proteiini-vuorovaikutustutkimuksissa sekä diagnostiikan kehittämisessä.
Proteiinien ekspressiopalvelu
Proteiinien ekspressio E. colissa
Asiakas toimittaa ekspressiovektorin, ja ekspressio varmistetaan ensin käyttäen pullo- tai kuoppalevyviljelyjä (mikä mahdollistaa myös kasvatusliuoksen optimoinnin). Positiivisten tulosten jälkeen tuotanto voidaan aloittaa käyttäen pulloja ravistimissa tai pienikokoisessa fermentorissa.
Bioreaktorilaboratorio tarjoaa proteiinituotantoa bakteeripohjaisessa isännässä 4,5 litran erissä käyttäen Labfors Infors 3 -fermentoria. Tarkasti ohjatut kasvuolosuhteet mahdollistavat suuremman solutiheyden ja paremman tuotteen laadun verrattuna perinteisiin pulloviljelyihin.
PS lähettää lopulliset tuotteet asiakkaalle ja raportoi SDS-PAGE- ja Western Blot -tulokset (asiakasta pyydetään toimittamaan vasta-aineet WB:tä varten, mikäli tavallinen vasta-aine ei ole saatavilla).
Bakulovirus-ekspressiovektori (BEVS)
Asiakas toimittaa halutun insertin plasmidivektorissa ja asiakasta pyydetään vahvistamaan klooni DNA-sekvensoinnilla. Tarvittaessa DNA-sekvensointi voidaan tehdä myös Tampereen yliopistossa.
Huomio! PS pyytää mittaamaan ja merkitsemään toimitetun plasmidin pitoisuuden (vähintään 5 ng, V=25 µl).
Donoriplasmidia käytetään valmistamaan kolme tai kuusi bakmidia, jotka varmistetaan PCR:llä, minkä jälkeen kolme niistä transfektoidaan Sf9-hyönteissoluihin (tarvittaessa HighFiveTM-solut). Sekundaarisen viruksen (P2) tilavuus on tyypillisesti 50 ml, ja proteiinin ekspressio varmistetaan Western Blotilla solupelletistä ja viljelynesteestä (vasta-aineet mahdollista puhdistus-tagia vastaan tai asiakkaan toimittamina). Virus varastoidaan kuukaudeksi ja sitä voidaan käyttää ekspression optimointiin tai mahdolliseen tuotannon laajentamiseen enintään 4,5 litraan 500 ml:n annoksina. Lisäksi proteiinipuhdistus His-tagilla tai Strept-tagilla on myös mahdollista.
Nisäkässolulinja transfektiota, ekspressiota ja suuren mittakaavan rekombinanttiproteiinituotantoa varten
Asiakas toimittaa halutun cDNA:n sopivassa plasmidivektorissa ja asiakasta pyydetään vahvistamaan klooni sekvensoinnilla. Tarvittaessa DNA-sekvensointi voidaan tehdä myös Tampereen yliopistossa.
Ekspressiovektori transfektoidaan nisäkässoluihin (CHO-S tai HEK 293F) ennen neljän viikon pituista solulinjan valintaa. Pilottikokeen ekspressiosta tehdään SDS-PAGE ja Western blot, joilla varmistetaan halutun proteiinin ekspressio. Solulinjat säilytetään neljä kuukautta käytettäväksi jatkotuotantoon. Päätös mittakaavan laajentamisesta pyydetään antamaan kuukauden sisään. Laajennuksessa solut sopeutetaan ensin suspensiokasvuun, ja proteiinin ekspressio varmennetaan SDS-PAGE:lla ja Western blotilla 50 ml:n näytteestä. Tämä vaihe kestää noin kaksi viikkoa, jonka jälkeen laajennus 5 litraan on mahdollista.
Proteiinin eristys, puhdistus ja karakterisointi
Isäntäsolut kerätään sentrifugoinnilla ja lysoidaan käyttäen joko tehokasta sonikaattoria tai korkeapaineista homogenisaattoria (Emulsiflex). Proteiinin eristys ja puhdistus tehdään yleensä kromatografisilla menetelmillä. Proteiinin laadun arviointi voidaan tehdä useilla menetelmillä, mukaan lukien analyyttinen geelisuodatus, SDS-PAGE, 2-D-elektroforeesi, dynaaminen valonsironta, kalorimetriset menetelmät ja biosensorit. Proteiinien kiteytyspalvelua on myös saatavilla. Proteiinit voidaan toimittaa joko liuoksena tai jäädytettynä.
Resurssit-välilehden alla on lyhyt yhteenveto käytettävissä olevista menetelmistä ja laitteista.
